纵观生物成像的历史，科学家和工程师为看得更多携手并进。有时，取得进步，我们得以用更高的分辨率来观察事物；有时他们帮助我们更深入地观察样本。然而，生物学家希望同时做到以上两方面，促进了新的方法，如多光子显微镜的诞生。

   在共聚焦显微镜下，单个光子激发样品中的荧光标记。在双光子显微镜（多光子显微镜的最常见形式）中，标记几乎在同一瞬间吸收了两个光子。多光子显微镜还使用波长更长的光子，它们能量较低，穿透力更深，在对更远的样本成像时对组织的损害较小。

   随着生物技术的改进，或新方法的发展，解析生物样本中深层结构的能力不断发展，同时在制备，操作和分析方面仍需要相当多的专业知识。在许多方面，科学进步的这两个关键要素（技术和工艺）正协同发展，有助于成像揭示更多的生物世界。

 

技术整合

 

   科学家们需要商业平台来扩大多光子成像的使用范围。尼康公司的A1R HD多光子共聚焦显微镜就是其中之一。该公司位于纽约市梅尔维尔。这款显微镜的一个主要特点是以每秒30帧的速度采集整个视场的数据。尼康公司生物系统的产品经理Adam White说：“有了A1R HD，科学家可以高速捕捉高质量的图像”。

   蔡司公司（德国奥伯科亨）生产的LSM 880 Airyscan能够提供多光子成像。蔡司公司决策部经理和应用开发工程师Joseph Huff说。“加入Airyscan探测器可将信噪比提高4至8倍，在小鼠大脑上使用这种设置，我们可以获取深度达500微米的数据。”

   然而，深焦会有一些弊端。奥林巴斯产品经理Carlo Alonzo说：“随着深入组织，球面像差的数量会增加。“这不仅会降低焦距，导致分辨率降低，而且由于多光子激发的效率降低，图像也会变暗。”

   为此，奥林巴斯开发了TruResolution物镜。Alonzo解释：“电动光学校正环可根据显微镜的z焦点动态调整，” 通过使这一过程自动化，这些物镜提供了一个体积图像，可以更好地保持从顶部到底部的z-stack亮度和分辨率。该物镜可与奥林巴斯FLUOVIEW FVMPE-RS多光子显微镜一起使用，安装简便。使用该设备，研究人员可以更轻松地捕获组织深处的细小特征，例如神经元上的亚微米大小的树突棘。

 

捕获透明组织 

 

   不仅提升硬件可以改善深部组织成像，组织透明技术也可以。它可使样品几乎透明，从而使得在更深层次的成像变得更容易。

   Visikol公司（位于新泽西州怀特豪斯站）的首席科学官Tom Villani指出，除了让光子进入组织更深处，“许多清除剂可以稳定荧光团，这是有用的副作用。”另外，Visikol HISTO透明剂易于使用。“我让高中实习生清除组织！” Villani说。

   组织类型会影响过程。 Villani说：“大脑，皮肤和肺部都很容易，但是肾脏和肝脏等色素丰富的组织更难。”显微镜也很重要。在几乎任何共聚焦范围内，都可以在Visikol HISTO清除的组织中1~2 mm处获得图像。他说：“你需要双光子或光片荧光显微镜和水浸物镜才能超过4毫米深度。”

   为了从透明化样品中获得特别清晰的图像，尼康开发了一种新的20倍甘油浸没物镜。它具有较高的数值孔径（1.0）和良好的工作距离（8.2 mm）。为了达到这种清晰度，物镜必须很大：它的长度为90毫米，直径为48毫米——两者的尺寸均比平均20倍的物镜大50％。

   蔡司的Lightsheet Z.1显微镜适用于透明化样品。Huff说：“对于大块组织成像，组织透明化试剂和光片是不错的选择。”该成像平台包括从右侧和左侧的照明路径。因此，蔡司光学显微镜北美产品营销小组经理Scott Olenych说：“您可以看到实时成像的共焦深度是原来的两倍。”尽管增加了深度，使用光片技术的真正好处是速度。“相比之下，共焦成像相当慢，” Olenych解释说。“光片可以穿过几毫米甚至更深，因为它使用照相机而不是光电倍增管。”

 

描绘发病机制

 

   在加尔维斯顿的德克萨斯大学医学分院，内科教授Joan Nichols和她的同事使用多光子显微镜研究人类疾病的发病机制。疾病过程通常涉及细胞和细胞外基质（支撑细胞的支架）的变化。为了了解这些过程，Nichols乐于对基质以及产生和修改基质的活细胞的变化进行成像。她说：“在基质中，多光子的效果惊人。它可以让你做一些深层的成像：在100微米或更高。”从这个深度，她可以更好地评估组织，细胞和支持胞外基质中发生疾病驱动的变化。她说：“我们可以同时做控制组和实验组，并在选定的时间段内反复成像。”

   这项工作的关键是在疾病发展的过程中将目光投向同一个地方。使用传统的光学显微镜，样品可固定并逐片成像。Nichols解释说“但是随着时间的推移，在没有固定组织的情况下观察控制组和实验组的组织可以让你看到实时的变化——反复到同一个点去寻找那个区域的变化。” 

   Nichols和她的同事研究的疾病是肺纤维化。为此，他们通过制作3D培养的细胞（类器官）来开发生物工程化的肺组织，模仿人体器官的特征。这种类器官可以用多光子显微镜成像，以比较并分析健康和纤维化或病变的组织。

 

“通往大脑的‘窗口’”

 

   但有时光有类器官还不够。在瑞士苏黎世大学，神经科学教授Sebastian Jessberger利用多光子显微镜研究活体小鼠的大脑，以了解哺乳动物的海马体是如何在整个生命周期中产生神经元的，尤其是在一种被称作齿状回的结构中。此前，Jessberger曾研究固定细胞，但他希望有更好的方法来研究神经元的产生。因此，通过精心的手术，Jessberger将海马体暴露在脑部，并在大脑中制造了一个“窗口”，可以在小鼠继续表现出正常行为范围的几个月甚至几年间内，用于实时成像。

   Jessberger标记小鼠的干细胞，并通过多光子显微镜追踪这些细胞。他解释说：“我们观察了出生在成年海马体中的神经元和在胚胎发育中的神经元，由此试图了解在细胞水平上发生了什么。”到目前为止，该技术的成像深度达到约1毫米。

   Jessberger希望使用三光子显微镜（由Chris Xu和纽约州伊萨卡市康奈尔大学的Xu研究小组共同开发）看到可能是2毫米或更深的范围。他说：“最终，我们希望能够在不去除部分皮质的情况下到达齿状回或海马体。”

   有了这些进展，Jessberger和他的同事们期望探索大脑发育的更多方面。例如，称为少突细胞的胶质细胞将髓磷脂添加到某些神经元的外面，从而提供绝缘作用，加速电信号在这些细胞中的流动。Jessberger希望能长期追踪这些细胞。他说：“也许我们可以学会预测哪些细胞可以脱髓鞘，哪些细胞不能。”这可以帮助科学家更好地理解多发性硬化症等疾病，这些疾病源于髓鞘形成缺陷。

   LaVision BioTec（德国贝吉施格拉德巴赫Miltenyi Biotec公司）的科学家对三光子显微镜的价值表示赞同。LaVision BioTec的高级产品专家Rafael Kurtz说： “由三个光子引起激发时，双光子激发给深层组织成像带来的巨大优势将成倍增加。我们证明了三光子激发在各种不同组织中进行深层组织成像的优势。”

   一种好处是能够穿透骨骼，这可以改善大脑研究。Kurtz指出：“到目前为止，必须在头骨上切开一个窗口，才能实现脑部显微成像，三光子成像由于其出色的骨骼渗透能力，现在可以对大脑活动进行全颅成像。”

   另一个优点是骨成像本身就是三光子显微镜的一种应用。LaVision BioTec公司的科学家利用三光子成像和1700纳米左右的激发，用“红色荧光染料和THG(三次谐波产生)信号创建了清晰的图像，其深度几乎是经典双光子显微镜所达到的两倍”。Kurtz说：“造血，干细胞迁移和免疫学记忆的关键步骤隐藏在骨髓深处。用三光子显微镜对骨髓进行长期的腔内成像将有助于探索这些问题。”

 

发挥作用

 

   多光子显微镜比过去容易得多，但它与常规的光成像有很大的不同。Jessberger说：“它不像一个普通的共焦，你买了放在工作台上，它就可以工作，你需要一个了解物理学且至少可以部分使用的人。并且它还需要时常进行调整。”

   Nichols对于需要专家协助表示认同。她说：“我们要与一个外部团队密切合作，帮助我们设置成像和评估，大多数科学家需要依靠显微镜专家与他们合作。”事实上，多数大型大学也都雇佣了专门从事多光子显微镜研究的内部人员。

   Nichols提到了多光子用户面临的另一个挑战：可用性。有些设施将配备一些仪器，但并非总是如此。

   仅仅想要多光子成像是不够的。科学家还需要购买或预约要用的仪器，培养这种类型成像所需的技能，并学会准备样品以获得最佳结果。

 

创建组合

 

   最大的进步可能来自于将先进的成像技术与其他技术相结合。例如，Jessberger描述了他的小组在对相同细胞的克隆或集群进行成像，然后观察其RNA的方法。他说：“你可以利用这些细胞中RNA含量的知识，然后在一定时间内追踪这些细胞的确切历史记录。”他补充说，这些类型的研究开始将分子机制与一系列解剖学变化联系起来。

   Nichols还结合技术研究肺功能。她利用显微计算机断层扫描技术来观察整个肺部的呼吸树，并利用多光子显微镜来观察细胞层面的结构变化。

   生物学家才刚刚开始探索多光子显微镜技术，具有清除技术的深层组织成像以及其他技术的可能组合。当然，随着越来越多的科学家加入，这些成像技术将会有更广泛的用途，也会有意想不到的发现。■

（译者李楠是老挝黄金赌场深圳先进技术研究院副研究员）

 

作者Mike May 是美国德克萨斯州的自由撰稿人。

鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2019年3月22日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy。

《科学新闻》 (科学新闻2021年4月刊 科学·生命)